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實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)（real-time PCR），屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時(shí)間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。定量方式包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量?？蓹z測(cè)mRNA，microRNA，lncRNA和DNA水平的基因拷貝數(shù)變化。
一具體方法
1.SYBRGreen法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）
2.TaqMan探針?lè)ǎ?/p>
探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
二、服務(wù)流程
1、引物設(shè)計(jì)與合成
2、DNA/RNA抽提
3、反轉(zhuǎn)錄（針對(duì)RNA）
4、上機(jī)定量分析
三、客戶提供
1、全血、組織或細(xì)胞。
2、引物，或由豐核提供。
3、基因信息：目的基因名稱、物種和序列（或GenBank Accession Number）。
四、交付內(nèi)容
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：詳細(xì)操作步驟
原始數(shù)據(jù)：溶解曲線圖，擴(kuò)增曲線圖，ct值
五、服務(wù)列表
項(xiàng)目 | 備注 | 周期 |
引物設(shè)計(jì)與合成 | 3個(gè)工作日 | |
提取 | RNA提取、miRNA提取、DNA提取 | 2個(gè)工作日 |
反轉(zhuǎn)錄 | 2個(gè)工作日 | |
qPCR反應(yīng) | SYBR Green方法，相對(duì)定量 | 2個(gè)工作日 |
